Imunochromatografia

z Wikipédie, slobodnej encyklopédie
Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání
Schéma testovacích prúžkov.

Laterálne prietokové testy (LFT)[1], známe aj ako laterálne prietokové imunochromatografické testy alebo rýchle testy, sú jednoduché zariadenia určené na zisťovanie prítomnosti cieľovej látky v kvapalnej vzorke bez potreby špecializovaného a nákladného vybavenia. Tieto testy sa široko používajú v lekárskej diagnostike na domáce testovanie, testovanie v mieste poskytovania zdravotnej starostlivosti alebo na laboratórne použitie. Napríklad domáci tehotenský test je LFT, ktorý zisťuje určitý hormón. Tieto testy sú jednoduché, ekonomické a výsledky sa spravidla zobrazia približne za päť až 30 minút.[2] Mnohé laboratórne aplikácie zvyšujú citlivosť jednoduchých LFT použitím ďalšieho špecializovaného zariadenia.[3]

LFT fungujú na rovnakých princípoch ako enzýmové imunosorbentné testy (ELISA). V podstate tieto testy vedú tekutú vzorku po povrchu podložky s reaktívnymi molekulami, ktoré vizuálne vykazujú pozitívny alebo negatívny výsledok.[4] Podložky sú založené na sérii kapilárnych vrstiev, ako sú kúsky porézneho papiera, mikroštruktúrovaný polymér alebo spekaný polymér.[5][6] or sintered polymer.[7] Každá z týchto podložiek má schopnosť spontánne transportovať tekutinu (napr. moč, krv, sliny).

Vankúšik na vzorky funguje ako špongia a zadržiava prebytok tekutiny zo vzorky. Po nasiaknutí tekutina prúdi do druhej konjugovanej podložky, v ktorej výrobca uložil lyofilizované bioaktívne častice nazývané konjugáty (pozri ďalej) v matrici soli a cukru. Konjugátová podložka obsahuje všetky činidlá potrebné na optimalizovanú chemickú reakciu medzi cieľovou molekulou (napr. antigénom) a jej chemickým partnerom (napr. protilátkou), ktorý bol imobilizovaný na povrchu častice. Tým sa cieľové častice označia pri prechode podložkou a pokračujú na druhej strane do testovacích a kontrolných línií. Na testovacej línii sa zobrazí signál, často farebný ako pri tehotenských testoch. Kontrolná línia obsahuje afinitné ligandy, ktoré ukazujú, či vzorka prešla a či sú biomolekuly v konjugovanej podložke aktívne. Po prechode týmito reakčnými zónami sa tekutina dostane do konečného porézneho materiálu, knôtu, ktorý jednoducho slúži ako nádoba na odpad.

LFT môžu fungovať ako kompetitívne alebo sendvičové testy.

História[upraviť | upraviť zdroj]

LFT vychádzajú z papierovej chromatografie, ktorú v roku 1943 vyvinuli Martin[8] a Synge a v roku 1944 ju rozpracovali Consden, Gordon a Martin.[9][10] Po roku 1945 došlo v tejto oblasti k prudkému rozmachu.[8]

Synopsa[upraviť | upraviť zdroj]

Farebné častice[upraviť | upraviť zdroj]

V zásade sa môžu použiť akékoľvek farebné častice, najčastejšie sa však používa latex (modrá farba) alebo nanometrové častice zlata (červená farba).[11] Zlaté častice majú červenú farbu v dôsledku lokalizovanej rezonancie povrchového plazmonu. Môžu sa použiť aj fluorescenčné alebo magneticky označené častice, ktoré však vyžadujú použitie elektronickej čítačky na vyhodnotenie výsledku testu.

Sendvičové testy[upraviť | upraviť zdroj]

Rozdiel medzi sendvičovou a kompetitívnou formou testov laterálneho toku. Sendvičové testy sa vo všeobecnosti používajú pre väčšie analyty, pretože majú tendenciu mať viac väzobných miest. Keď vzorka migruje cez test, najprv sa stretne s konjugátom, čo je protilátka špecifická pre cieľový analyt označená vizuálnou značkou, zvyčajne koloidným zlatom. Protilátky sa viažu na cieľový analyt vo vzorke a migrujú spolu, až kým nedosiahnu testovaciu líniu. Testovacia linka obsahuje aj imobilizované protilátky špecifické pre cieľový analyt, ktoré sa viažu na migrujúce molekuly konjugátu viazané na analyt. Testovacia čiara potom predstavuje vizuálnu zmenu v dôsledku koncentrovanej vizuálnej značky, čím sa potvrdí prítomnosť cieľových molekúl. Väčšina sendvičových testov má aj kontrolnú líniu, ktorá sa objaví bez ohľadu na prítomnosť cieľového analytu, aby sa zabezpečila správna funkcia podložky laterálneho toku.

Rýchly, lacný sendvičový test sa bežne používa na domáce tehotenské testy, ktoré zisťujú ľudský choriový gonadotropín, hCG, v moči tehotných žien.

Konkurenčné testy[upraviť | upraviť zdroj]

Konkurenčné testy sa zvyčajne používajú pre menšie analyty, pretože menšie analyty majú menej väzobných miest. Vzorka sa najprv stretne s protilátkami proti cieľovému analytu označeným vizuálnou značkou (farebné častice). Testovacia línia obsahuje cieľový analyt fixovaný na povrchu. Keď cieľový analyt vo vzorke chýba, nenaviazané protilátky sa viažu na tieto fixované molekuly analytu, čo znamená, že sa objaví vizuálna značka. Naopak, keď je cieľový analyt prítomný vo vzorke, viaže sa na protilátky, aby zabránil ich väzbe na fixovaný analyt v testovacej línii, a preto sa nezobrazí žiadna vizuálna značka. Od sendvičových testov sa to líši v tom, že žiadny pruh znamená, že analyt je prítomný.

Kvantitatívne testy[upraviť | upraviť zdroj]

Väčšina LFT je určená na čisto kvalitatívny základ. Je však možné merať intenzitu testovacej čiary na určenie množstva analytu vo vzorke. Niekoľko spoločností používa ručné diagnostické zariadenia známe ako čítačky laterálneho toku, ktoré poskytujú plne kvantitatívny výsledok testu. Využitím jedinečných vlnových dĺžok svetla na osvetlenie v spojení s detekčnou technológiou CMOS alebo CCD možno vytvoriť obraz aktuálnych testovacích línií bohatý na signál. Pomocou algoritmov spracovania obrazu špeciálne navrhnutých pre konkrétny typ testu a médium možno potom intenzitu čiar korelovať s koncentráciami analytov. Jednu takúto platformu ručného zariadenia pre laterálny tok vyrába spoločnosť Detekt Biomedical L.L.C.. Alternatívne neoptické techniky sú tiež schopné poskytovať kvantitatívne výsledky testov. Jedným z takýchto príkladov je magnetická imunoanalýza (MIA) vo forme LFT, ktorá tiež umožňuje získať kvantifikovaný výsledok. Zníženie odchýlok v kapilárnom čerpaní tekutiny zo vzorky je ďalším prístupom, ktorý umožňuje prejsť od kvalitatívnych ku kvantitatívnym výsledkom. Nedávna práca napríklad preukázala kapilárne čerpanie s konštantným prietokom nezávislým od viskozity a povrchovej energie kvapaliny.

Ukázalo sa, že mobilné telefóny majú veľký potenciál na kvantifikáciu v testoch laterálneho prietoku, a to nielen využitím fotoaparátu zariadenia, ale aj svetelného senzora alebo energie dodávanej batériou mobilného telefónu.

Kontrolná linka[upraviť | upraviť zdroj]

Hoci to nie je nevyhnutne potrebné, väčšina testov obsahuje druhú líniu, ktorá obsahuje protilátku, ktorá zachytáva voľný latex alebo zlato, aby sa potvrdilo správne fungovanie testu.

Extrakcia krvnej plazmy[upraviť | upraviť zdroj]

Pretože intenzívne červené sfarbenie hemoglobínu ruší odčítanie diagnostických testov založených na kolorimetrickej alebo optickej detekcii, separácia krvnej plazmy je bežným prvým krokom na zvýšenie presnosti diagnostického testu. Plazmu možno extrahovať z plnej krvi prostredníctvom integrovaných filtrov alebo aglutináciou.

Rýchlosť a jednoduchosť[upraviť | upraviť zdroj]

Čas potrebný na získanie výsledku testu je pre tieto výrobky kľúčovým faktorom. Vypracovanie testov môže trvať len niekoľko minút. Vo všeobecnosti existuje kompromis medzi časom a citlivosťou: vypracovanie citlivejších testov môže trvať dlhšie. Ďalšou kľúčovou výhodou tohto formátu testu v porovnaní s inými imunoanalýzami je jednoduchosť testu, pretože si zvyčajne vyžaduje len malú alebo žiadnu prípravu vzorky alebo činidla.

Aplikácie[upraviť | upraviť zdroj]

Testy bočného toku majú širokú škálu aplikácií a môžu testovať rôzne vzorky, ako je moč, krv, sliny, pot, sérum a iné tekutiny. V súčasnosti ich používajú klinické laboratóriá, nemocnice a lekári na rýchle a presné testy špecifických cieľových molekúl a expresie génov. Ďalšie využitie testov laterálneho toku je bezpečnosť potravín a životného prostredia a veterinárna medicína na chemické látky, ako sú choroby a toxíny. LFT sa bežne používajú aj na identifikáciu chorôb, ako je napríklad ebola, ale najbežnejším LFT je domáci tehotenský test.

testovanie COVID-19[upraviť | upraviť zdroj]

Laterálne prietokové testy zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri testovaní COVID-19, pretože ich výhodou je, že výsledok sa získa do 15 - 30 minút. Systematické hodnotenie testov laterálneho prietoku počas pandémie COVID-19 sa začalo na Oxfordskej univerzite v rámci spolupráce Spojeného kráľovstva s Public Health England. Štúdia FALCON-C19, ktorá sa začala v júni 2020 v Spojenom kráľovstve, potvrdila citlivosť niektorých zariadení s laterálnym prietokom (LFD) v tomto prostredí. Štyri zo 64 testovaných LFD mali žiaduce výkonnostné charakteristiky; najmä rýchly kvalitatívny test s antigénom SARS-CoV-2 Innova prešiel rozšíreným klinickým hodnotením v terénnych štúdiách a zistilo sa, že má dobrú detekciu/citlivosť vírusového antigénu s vynikajúcou špecificitou, hoci potenciálnymi problémami boli miera zlyhania súpravy a vplyv školenia. Po vyhodnotení sa vláda Spojeného kráľovstva v januári 2021 rozhodla otvoriť stredné školy v Anglicku, kde žiaci a učitelia denne vykonávajú LFT, čo bolo súčasťou tzv. operácie Moonshot. MHRA však 19. januára 2021 nepovolila denné testy s rýchlym obratom ako alternatívu k samovyšetreniu.

LFT sa celosvetovo používali na hromadné testovanie na COVID-19 a dopĺňajú iné opatrenia v oblasti verejného zdravia na COVID-19.

Niektorí vedci mimo štátnej správy vyjadrili vážne pochybnosti o používaní LFD Innova na skríning na Covid. Podľa Jona Deeksa, profesora biostatistiky na Birminghamskej univerzite v Anglicku, je test Innova "úplne nevhodný" na testovanie v komunite: "keďže test môže vynechať až polovicu prípadov, negatívny výsledok testu naznačuje znížené riziko Covidu, ale Covid nevylučuje". Po kritike zo strany odborníkov a chýbajúcej autorizácii zo strany regulačného orgánu vláda Spojeného kráľovstva v polovici januára 2021 "pozastavila" každodenné testovanie LFT v anglických školách.

Referencie[upraviť | upraviť zdroj]

  1. Concurrent Engineering for Lateral-Flow Diagnostics (IVDT archive, Nov 99) Archived 15 apríl 2014 at the Wayback Machine
  2. Lateral flow assays. Essays in Biochemistry, 30 June 2016, s. 111–120. ISSN 0071-1365. DOI10.1042/EBC20150012. PMID 27365041.
  3. Yetisen A. K.. Paper-based microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab on a Chip, 2013, s. 2210–2251. DOI10.1039/C3LC50169H. PMID 23652632.
  4. Lateral Flow Introduction [online]. . Dostupné online.
  5. Synthetic microfluidic paper: high surface area and high porosity polymer micropillar arrays. Lab on a Chip, 2016, s. 298–304. Dostupné online. DOI10.1039/C5LC01318F. PMID 26646057.
  6. Viscosity Independent Paper Microfluidic Imbibition. MicroTAS 2016, Dublin, Ireland, 2016. Dostupné online.
  7. Sample Collection & Transport | Sample Preparation | Sample Analysis [online]. . Dostupné online.
  8. a b Vegetable tannins – Lessons of a phytochemical lifetime. Phytochemistry, 2007, s. 2713–21. DOI10.1016/j.phytochem.2007.09.009. PMID 18037145.
  9. Qualitative analysis of proteins: A partition chromatographic method using paper. Biochemical Journal, 1944, s. 224–232. DOI10.1042/bj0380224. PMID 16747784.
  10. Paper chromatography | chemistry. Encyclopedia Britannica. Dostupné online [cit. 2018-06-01]. (po anglicky)
  11. Nanoparticle-based lateral flow biosensors. Biosensors & Bioelectronics, 2015, s. 47–63. Dostupné online. DOI10.1016/j.bios.2015.05.050. PMID 26043315.

Pozri aj[upraviť | upraviť zdroj]