Oligonukleotid

z Wikipédie, slobodnej encyklopédie
Skočit na navigaci Skočit na vyhledávání
Eteplirsen je príkladom oligonukleotidu. Obsahuje chemicky upravnú cukorfosfátovú kostru.

Oligonukleotidy sú krátke molekuly RNA alebo DNA, ktoré majú široké využitie v genetickom testovaní, výskume a forenzných vedách. Sú to oligoméry nukleotidov. Bežne sa vyrábajú v laboratóriu pomocou chemickej syntézy na pevnej fáze.[1] Tieto krátke úseky nukleových kyselín je možné vyrobiť ako jednovláknové molekuly s požadovanou sekvenciou, takže sú veľmi dôležité pre syntézu umelých génov, polymerázovú reťazovú reakciu (PCR), sekvenovanie DNA, molekulárne klonovanie a i ako molekulárne sondy. V prírode sú oligonukleotidy zvyčajne prítomné ako malé molekuly RNA, ktorých úlohou je regulácia expresie génov (napríklad mikroRNA),[2] alebo ako medziprodukty rozkladu väčších molekúl nukleových kyselín.

Oligonukleotidy sú charakteristické svojou sekvenciou (poradím) nukleotidov, z ktorých sa skladajú. Dĺžka oligonukleotidu je zvyčajne popísaná koncovkou "-mér" (z gréckeho meros, "časť"). Napríklad oligonukleotid, ktorý má šesť nukleotidov (nt), sa označuje ako hexamér a oligonukleotid s dĺžkou 25 nt sa označuje ako "25-mér". Oligonukleotidy sa ľahko viažu (na základe svojej sekvencie) na komplementárne oligonukleotidy, DNA alebo RNA, čím vznikajú duplexy alebo, menej často, hybridy.Táto vlastnosť tvorí základ ich použitia ako molekulárnych sond na detekciu konkrétnych sekvencií DNA alebo RNA. Príkladmi postupov, ktoré využívajú oligonukleotidy, sú DNA čipy (tiež známe ako DNA microarray), Southernov blotting, ASO analýza, fluorescentná in situ hybridizácia (FISH), PCR a syntéza umelých génov.

Oligonukleotidy sa skladajú z ribonukleotidov alebo deoxyribonukleotidov a môžu mať upravenú cukor-fosfátovú kostru, čím je možné dosiahnuť rôzne farmakologické efekty. Pri použití deoxyribonukleotidov je možné upraviť i 2' pozíciu na sacharide. Tieto úpravy dávajú oligonukleotidov nové vlastnosti a hrajú kľúčovú úlohu pri antisense terapii.[3][4]

Syntéza[upraviť | upraviť zdroj]

Bližšie informácie v hlavnom článku: Syntéza oligonukleotidov

Oligonukleotidy sú chemicky syntetizované pomocou stavebných kameňov (nukleotidov), chránených fosforamiditov prírodných alebo chemicky modifikovaných nukleozidov alebo v menšej mierez nenukleozidových zlúčenín. Tvorba oligonukleotidového reťazca prebieha v smere od 3' konca ku 5' koncu opakovaním rutinného postupu, tzv. "syntetického cyklu". Jeden syntetický cyklus vedie k naviazaniu jedného oligonukleotidu k vzniknutého reťazcu. Tento proces je čiastočne limitovaný tým, že reakcie majú výťažok nižší než 100 % a že v procese môžu vznikať vedľajšie produkty. Všeobecne sú sekvencie oligonukleotidov relatívne krátke (13-25 nukleotidov).[5] Maximálna dĺžka syntetického oligonukleotidu len sťažka prekročí dĺžku 200 nukleotidov. Na izoláciu produktov s požadovanou sekvenciou je možné použiť HPLC alebo iné metódy.

Chemické úpravy[upraviť | upraviť zdroj]

Jednou z prvých komplikácii ASO terapie bola tvorba chemicky stabilných krátkych oligonukleotidov. Prírodné oligonukleotidy sa ľahko rozkladajú pôsobením nukleáz, teda enzýmov, ktoré štepia nukleotidy, hojne prítomných vo všetkých druhoch buniek.[6] Krátke oligonukleotidy majú slabšie väzbové afinity, čo prispieva k ich rozkladu in vivo.[7]

Úpravy cukor-fosfátovej kostry[upraviť | upraviť zdroj]

Organotiofosfátové nukleozidové (PS) analógy nukleotidov dávajú oligonukleotidom prospešné vlastnosti. Medzi ne patrí diastereomérická identifikácia každého nukleotidu a možnosť jednoducho sledovať reakcie, ktorých sa účastnia fosforotioátové nukleotidy, čo je u syntézy oligonukleotidov užitočné.[8] PS úprava takisto chráni oligonukleotidy pred nežiadaným rozkladom enzýmami.[9] Úprava nukleotidovej kostry je bežne používaná, pretože je u väčšiny nukleotidov dosiahnuteľná relatívne jednoducho a presne.[8] Fluorescentné modifikácie na 5' a 3' koncoch oligonukleotidov boli použité na určenie štruktúry oligonukleotidov, dynamiky a interakcie s okolím.[10]

Úpravy sacharidového kruhu[upraviť | upraviť zdroj]

Ďalšou úpravou, ktorá je užitočná pre použitie v medicíne, je úprava 2' pozície cukru. Úprava tejto pozície zvyšuje efektivitu viazania oligonukleotidov pomocou zlepšenia viazacích schopností oligonukleotidov, hlavne u antisense oligonukleotidovej terapie.[7] Takisto znižuje nešpecifické viazanie proteínov, čím sa zvyšuje presnosť viazania špsecifických bielkovín.[7] Dve bežne používané úpravy sú 2’-O-metyl a the 2’-O-metoxyetyl.[7] Takisto boli popísané fluorescentné modifikácie nukleobáz.[10]

Antisense oligonukleotidy[upraviť | upraviť zdroj]

Bližšie informácie v hlavnom článku: Antisense terapia

Antisense oligonukleotidy (ASO) sú jednovláknové molekuly DNA alebo RNA, ktoré sú komplementárne k zvolenej sekvencii.[5] V prípade antisense RNA je ich úlohou prevencia translácie nektorých mRNA tým, že sa na ne oligonukleotid naviaže, čo sa nazýva hybridizácia.[11] ASO je možné použiť na zameranie konkrétnej komplementárnej RNA (kódujúcej i nekódujúcej). Ak dôjde k viazaniu, hybrid môže byť degradovaný enzýmom RNázou H.[11] RNáza H je enzým, ktorý hydrolyzuje RNA a keď sa využije pri aplikácii antisense oligonukleotidov, dochádza k zníženiu expresie mRNA o 80-95 %.[5]

Použitie morfolíno antisense oligonukleotidov na zníženie expresie génov u stavovcov, čo je aktuálne štandardnou technikou používanou v vývojovej biológii a takisto sa používa pri štúdiách upravenej expresie génov a funkcie génov, bolo prvýkrát vyvinuté Janet Heasmanovou na žabách Xenopus.[12] Medzi lieky so štruktúrou morfolína, ktoré sú povolené americkou FDA, patria eteplirsen a golodirsen. Antisense oligonukleotidy boli takisto použité na inhibíciu replikácie chrípkového vírusu.[13][14]

Neurodegeneratívne poruchy, ktoré vznikajú kvôli jedinému mutantnému proteínu, sú dobrými cieľmi pre antisense nukleotidovú terapiu vďaka ich schopnosti zacieliť a upraviť veľmi špecifické sekvencie RNA s vysokou selektivitou.[15] Mnohé choroby, napríklad Huntingotonova choroba, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a amyotrofná laterálna skleróza (ALS), boli prepojené so zmenami DNA, z ktorých vznikajú nesprávne sekvencie RNA a tým vznikajú chybne preložené proteíny s toxickými fyziologickými vlastnosťami.[16]

Analytické techniky[upraviť | upraviť zdroj]

Chromatografia[upraviť | upraviť zdroj]

Alkylamidy je možné použiť v chromatografii ako stacionárnu fázu.[17] Tieto fázy boli skúmané pre použitie na separáciu oligonukleotidov.[18] Iónová párová everzne fázová vysokoúčinná kvapalnová chromatografia sa používa na separáciu a analýzu oligonukleotidov po ich automatizovanej syntéze.[19]

Hmotnostná spektrometria (MS)[upraviť | upraviť zdroj]

Zmes kyseliny 5-metoxysalicylovej a spermínu sa dá použiť ako matrix pre analýzu oligonukleotidov pomocou MALDI MS.[20] Elektrosprejová ionizačná hmotnostná spektroskopia (ESI-MS) je takisto silným nástrojom na charakterizáciu hmotnosti oligonukleotidov.[21]

DNA microarray[upraviť | upraviť zdroj]

DNA čipy (microarray) sú užitovné analytické aplikácie oligonukleotidov. V porovnaní so štandardnými cDNA mčipmi majú čipy založené na oligonukleotidoch lepšie definovanú špecificitu hybridizácie a schopnosť merať/detegovať prítomnosť a prevahu alternatívne zostrihnutých alebo polyadenylovaných sekvencií.[22] Jeden poddruh DNA čipov je možné popísať ako substráty (nylon, sklo...), na ktoré sa s vysokou hustotou viažu oligonukleotidy.[23] Existuje mnoho aplikácié DNA mikročipov v živých vedách.

Referencie[upraviť | upraviť zdroj]

  1. Solid-Phase Synthesis of Phosphorothioate Oligonucleotides Using Sulfurization Byproducts for in Situ Capping. The Journal of Organic Chemistry, October 2018, s. 11577–11585. DOI10.1021/acs.joc.8b01553. PMID 30179468.
  2. VIRmiRNA: a comprehensive resource for experimentally validated viral miRNAs and their targets. Database, 1 January 2014, s. bau103. DOI10.1093/database/bau103. PMID 25380780.
  3. Weiss, B., ed. (1997). Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents. Boca Raton, Florida: CRC Press
  4. Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cellular and Molecular Life Sciences, 1999, s. 334–58. DOI10.1007/s000180050296. PMID 10228554.
  5. a b c Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. Molecular Cancer Therapeutics, March 2002, s. 347–55. Dostupné online. PMID 12489851.
  6. Antisense oligonucleotide therapies: the promise and the challenges from a toxicologic pathologist's perspective. Toxicologic Pathology, January 2015, s. 78–89. DOI10.1177/0192623314551840. PMID 25385330.
  7. a b c d Antisense oligonucleotides: treating neurodegeneration at the level of RNA. Neurotherapeutics, July 2013, s. 486–97. DOI10.1007/s13311-013-0194-5. PMID 23686823.
  8. a b Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them?. Antisense & Nucleic Acid Drug Development, April 2000, s. 117–21. DOI10.1089/oli.1.2000.10.117. PMID 10805163.
  9. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research, April 1988, s. 3209–21. DOI10.1093/nar/16.8.3209. PMID 2836790.
  10. a b Probing of Nucleic Acid Structures, Dynamics, and Interactions With Environment-Sensitive Fluorescent Labels. Frontiers in Chemistry, 2020, s. 112. DOI10.3389/fchem.2020.00112. PMID 32181238. (English)
  11. a b Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics, April 2017, s. 70–77. DOI10.1089/nat.2016.0656. PMID 28080221.
  12. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental Biology, June 2000, s. 124–34. DOI10.1006/dbio.2000.9720. PMID 10885751.
  13. Cross-protective effect of antisense oligonucleotide developed against the common 3' NCR of influenza A virus genome. Molecular Biotechnology, November 2013, s. 203–11. DOI10.1007/s12033-013-9670-8. PMID 23729285.
  14. Nucleic acid-mediated cleavage of M1 gene of influenza A virus is significantly augmented by antisense molecules targeted to hybridize close to the cleavage site. Molecular Biotechnology, May 2012, s. 27–36. DOI10.1007/s12033-011-9437-z. PMID 21744034.
  15. ASPsiRNA: A Resource of ASP-siRNAs Having Therapeutic Potential for Human Genetic Disorders and Algorithm for Prediction of Their Inhibitory Efficacy. G3 (Bethesda, Md.), 2017, s. 2931–2943. Dostupné online. DOI10.1534/g3.117.044024. PMID 28696921.
  16. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation, August 2006, s. 2290–6. DOI10.1172/JCI25424. PMID 16878173.
  17. Chromatographic and related studies of alkylamide phases.. Chromatographia, August 1994, s. 155–61. DOI10.1007/BF02274494.
  18. Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography with alkylamide stationary phase.. Open Chemistry, January 2015. DOI10.1515/chem-2015-0141.
  19. Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides:: Retention prediction. Journal of Chromatography A, 2002-06-07, s. 167–182. Dostupné online. ISSN 0021-9673. DOI10.1016/S0021-9673(02)00306-0. PMID 12134814. (po anglicky)
  20. 5-Methoxysalicylic acid and spermine: a new matrix for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, April 2001, s. 456–62. DOI10.1016/S1044-0305(01)00212-4. PMID 11322192.
  21. An ESI-MS method for characterization of native and modified oligonucleotides used for RNA interference and other biological applications. Nature Protocols, March 2008, s. 351–6. DOI10.1038/nprot.2007.535. PMID 18323805.
  22. Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays. Nucleic Acids Research, June 2002, s. 51e–51. DOI10.1093/nar/30.11.e51. PMID 12034852.
  23. Multi-technique comparison of immobilized and hybridized oligonucleotide surface density on commercial amine-reactive microarray slides. Analytical Chemistry, April 2006, s. 2342–51. DOI10.1021/ac051812m. PMID 16579618.

Pozri aj[upraviť | upraviť zdroj]

Zdroj[upraviť | upraviť zdroj]

Tento článok je čiastočný alebo úplný preklad článku Oligonucleotide na anglickej Wikipédii.

Externé odkazy[upraviť | upraviť zdroj]

  • Interplay between metal ions and nucleic acids.. [s.l.] : Springer Science & Business Media, January 2012. DOI:10.1007/978-94-007-2172-2_3 Chapter 3. Metal-Ion-Promoted Conformational Changes of Oligonucleotides, s. 103–118.