Edmanova degradácia

Edmanova degradácia (v literatúre i ako Edmanovo odbúravanie), ktorú vyvinul Pehr Edman, je degradačna metóda sekvenovania aminokyselín v peptide. Pomocou tejto metódy sa reziduum na N-konci peptidu označí a odštiepi z peptidu bez porušenia ostatných peptidových väzieb aminokyselinových reziduí.

Mechanizmus

Edman Degradation with generic amino acid peptide chain.

Fenylizotiokyanát reaguje s nenabitou N-terminálnou amino skupinou v mierne zásaditom prostredí za tvorby fenyltiokarbamoylového derivátu. V kyslom prostredí sa potom tento derivát štiepi ako tiazolinónový derivát. Tiazolininónový derivát aminokyseliny sa následne extrahuje do organického rozpúšťadla a pôsobením kyseliny tvorí fenyltiohydantoínový derivát aminokyseliny, ktorý je možné identifikovať pomocou chromatografie alebo elektroforézy. Tento proces je možné opakovať a identifikovať tak ďalšiu aminokyselinu.

Veľká nevýhoda tejto metódy je maximálna dĺžka peptidu, ktorý je možné sekvenovať - maximálna dĺžka je asi 50-60 reziduí, v praxi okolo 30 reziduí. Maximálna dĺžka je obmedzená kvôli tomu, že tvorba cyklického derivátu neprebehne vždy úplne. Problém s nedostatočnou tvorbou derivátu je u väčších peptidov možné obísť štiepením na kratšie peptidy a následným sekvenovaním. Takto je možné presne sekvenovať až 30 aminokyselín. Moderné prístroje majú úspešnosť správneho určenia každej aminokyseliny viac ako 99 %.

Výhoda Edmanovej degradácie spočíva vo využití len 10-100 pikomolov peptidu. Edmanova degradácia bola automatizovaná v roku 1967 Edmanom a Beggsom, aby sa urýchlil sekvenačný proces, a v roku 1973 sa využívalo 100 automatických sekvenátorov po celom svete.

Obmedzenia

Keďže Edmanova degradácia využíva N-koniec proteínu, nie je možné ju využiť na chemicky modifikované N-konce peptidov (napríklad acetyláciou alebo tvorbou kyseliny pyroglutámovej). Sekvenácia sa zastaví, ak reťazec obsahuje aminokyselinu inú, než α-aminokyselinu (napríklad izoaspartát), keďže nie je možné vytvoriť preferovaný päťčlenný kruh. Edmanova degradácia sa všeobecne nedá použiť na určenie pozície disulfidických väzieb. Množstvo peptidu nutné na zisk merateľných výsledkov je aspoň 1 pikomol.

Spojená analýza

Po 2D SDS PAGE je možné proteíny preniesť na polyvinylidéndifluoridovú (PVDF) blotovaciu membránu na ďalšiu analýzu. Edmanovu degradáciu možné urobiť priamo na PVDF membráne. Sekvenovanie 5-10 N-terminálnych reziduí by mohlo postačovať na identifikáciu požadovaného proteínu.

Zdroj

Tento článok je čiastočný alebo úplný preklad článku Edman degradation na anglickej Wikipédii.

Chemický portál