Fosforylácia

z Wikipédie, slobodnej encyklopédie
Prejsť na: navigácia, hľadanie
Fosforylovaný serínový zvyšok

Fosforylácia je chemická reakcia, ktorej výsledkom je adícia (pridanie) jednej alebo viacerých fosfátových skupín (PO43-) na proteíny prípadne iné organické molekuly. Môže meniť štruktúru proteínov, ktoré fungujú ako enzýmy a meniť tak ich funkciu a aktivitu. Fosforylácia proteínov hrá významnú úlohu v mnohých bunkových procesoch. Z tohoto dôvodu sa stala predmetom mnohých biochemických výskumov.

Fosforylácia proteínov[upraviť | upraviť zdroj]

Dejiny[upraviť | upraviť zdroj]

V roku 1906 Phoebus A. Levene v Rockefellerovom ústave pre lekársky výskum identifikoval fosfát v bielkovine vitelín.[1] V roku 1933 Fritz Lipmann objavil fosfoserín v kazeíne.[2] O 20 rokov neskôr Eugene P. Kennedy opísal prvú „enzymatickú fosforyláciu proteínov“.[3]

Funkcia[upraviť | upraviť zdroj]

Reverzibilná fosforylácia proteínov je dôležitý regulačný mechanizmus, ktorý sa vyskytuje u prokaryotických aj eukaryotických organizmov.[4][5][6][7] Enzýmy, ktoré fosforylujú bielkoviny, sa nazývajú kinázy. Na defosforyláciu zase slúžia fosfatázy. Mnohé enzýmy a receptory sa v bunkách vyskytujú v konfiguráciách typu „vypnutý“ a „zapnutý“. Práve tieto dva stavy sú možné vďaka fosforylácii a defosforylácii. Reverzibilná fosforylácia vedie ku konformačným zmenám štruktúry mnohých enzýmov a receptorov, ktoré následne spôsobujú ich aktiváciu alebo deaktiváciu. Fosforylácia sa v eukaryotických proteínoch zvyčajne realizuje na aminokyselinách serín, treonín, tyrozín a na histidínových zvyškoch. Histidínová fosforylácia eukaryotických proteínov ja oveľa častejšia než fosforylácia na tyrozíne. Na proteínoch pochádzajúcich z prokaryotických buniek dochádza k fosforylácii zvyškov aminokyselín serín, treonín, tyrozín, histidín, arginín prípadne lyzín.[8][4][5][8][9] Pridaním fosfátových molekúl na polárne R skupiny aminokyselinových zvyškov sa môžu zmeniť hydrofóbne (vodu odpudzujúce) časti proteínov na polárne a extrémne hydrofilné (vo vode rozpustné) časti molekuly. Týmto spôsobom je možné previesť konformačnú zmenu v štruktúre proteínu prostredníctvom interakcie s inými hydrofóbnymi a hydrofilnými časťami proteínu. Ako príklad takejto regulácie možno uviesť fosforyláciu tumor supresorových proteínov p53. Proteín p53 je veľmi silno regulovaný[10] a obsahuje viac ako 18 rôznych miest, kde môže byť fosforylovaný/defosforylovaný. Aktivácia p53 môže viesť k zástave bunkového cyklu a za určitých okolností môže táto aktivácia viesť k apoptickej bunkovej smrti.[11] Táto aktivita sa vyskytuje len v situáciách kedy sú bunky poškodené, alebo je u zdravých jedincov narušená ich fyziológia. Po deaktivačnom signále je proteín opäť defosforylovaný a prestane fungovať.

Aktivácia fosforyláciou je mechanizmus, ktorý sa vyskytuje v mnohých formách prenosu signálu. Jedným z príkladov je napríklad spôsob akým sa spracováva svetlo v svetlocitlivých bunkách.

Regulačné úlohy fosforylácie (príklady)[upraviť | upraviť zdroj]

  • Termodynamika biologických systémov pre reakcie vyžadujúce energiu
  • Sprostredkovanie inhibície enzýmov
    • Fosforylácia enzýmu GSK-3 pomocou proteín kinázy B, ktorá je súčasťou inzulínovej signálnej dráhy[12]
    • Fosforylácia Src tyrozín kinázy cez C- terminálnu Src kinázu (Csk) indukuje zmenu štruktúry enzýmu, ktorá zneprístupní jeho „kinázové domény“ (miesta možnej fosforylácie) a tak sa „vypne“ jeho kinázová aktivita[13]
  • Proteín-proteínové interakcie prostredníctvom „rozpoznávacích domén“
  • Degradácia proteínov: V roku 1990 sa zistilo, že fosforylácia niektorých proteinov spôsobuje ich degradáciu cez ATP-dependentný ubiquitín/proteázomové dráhy. Tieto cieľové proteíny sa stanú substrátmi pre jednotlivé E3 ubiquitin ligázy iba vtedy, ak sú fosforylované

Signálne dráhy[upraviť | upraviť zdroj]

Objasnenie komplexnej signálnej dráhy fosforylácie môže byť náročné. V bunkových signálnych dráhach proteín A fosforyluje proteín B a proteín B potom fosforyluje proteín C. Avšak v iných signálnych dráhach proteín D fosforyluje proteín A, prípadne fosforyluje protein C. Globálne prístupy ako je fosfoproteomika (čo je štúdium fosforylovaných proteínov prostredníctvom proteomiky v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou), boli využité na identifikáciu a kvantifikáciu dynamických zmien fosforylovaných proteínov v priebehu času. Tieto techniky sú dôležité pre systematickú analýzu komplexných fosforylačných sietí.[15] Boli úspešne použité na identifikáciu dynamických zmien vo fosforylovanom stave na viac ako 6000 miestach po stimulácii epidermálnym rastovým faktorom.[16] Iný prístup k pochopeniu fosforylačných sietí je možný na základe merania genetických interakcií medzi viacerými fosforylovanými proteínmi a ich cieľmi. Takýmto spôsobom vznikajú zaujímavo sa opakujúce vzorce interakcií, tzv. sieťové motívy.[17]

Miesta proteínovej fosforylácie[upraviť | upraviť zdroj]

Existujú tisíce rôznych fosforylovaných miest v danej bunke, pretože:

  • Existuje tisíce rôznych druhov bielkovín v konkrétnej bunke (napríklad lymfocytov)
  • Odhaduje sa, že 1/10 až ½ proteínov je fosforylovaných v určitom stave bunky
  • Fosforylácia sa v danom proteíne často vyskytuje na niekoľkých rôznych miestach

Fosforylácia akéhokoľvek miesta na danom proteíne môže zmeniť funkciu alebo lokalizáciu tohoto proteínu. Napríklad, ak je fosforylovana aminokyselina serín-473 v proteíne AKT, tak proteín kináza B je funkčne aktívny ako kináza. V prípade, že proteín kináza B nie je fosforylovany, tak nie je aktívnou kinázou.

Typy fosforylácie[upraviť | upraviť zdroj]

Vo vnútri bielkoviny môže dôjsť ku fosforylácii na niekoľkých aminokyselinách. Najčastejšia je fosforylácia na seríne, druhá najčastejšia je na aminokyseline treonín. Tyrozínová fosforylácia je pomerne vzácna. Vzhľadom na to, že tyrozin-fosforylované proteíny je pomerne ľahké purifikovať pomocou protilátok, sú fosforylácie prostredníctvom tyrozínu pomerne dobre preskúmané. Fosforylácie histidínu a aspartátu sa vyskytujú hlavne u prokaryotických organizmov ako súčasť ich dvojzložkovej signalizácie. V niektorých prípadoch sa však môzu vyskytovať aj v signálnych dráhach u eukaryotických organizmov.[18]

Detekcia a charakterizácia[upraviť | upraviť zdroj]

Protilátky môžu byť použité ako výkonné nástroje pre detekciu toho, či je proteín na určitom mieste fosforylovaný. Protilátky sa naviažu do cieľového miesta a následne detekujú konformačné zmeny vyvolané fosforyláciou proteínov. Tieto protilátky sa nazývajú fosfo-špecifické. Aktuálne sú k dispozícii stovky týchto protilátok.[19] Sú to dôležité biochemické nástroje pre základný výskum aj klinickú diagnostiku.

Príklad posttranslačnej modifikácie detegovanej na 2D géli YUI (hranice boli vymedzené podľa analytického softvéru, identifikácia bola vykonaná hmotnostnou spektrometriou, P46462 je ID proteínu v Expasy)

PTM (Posttranslačné modifikácie) izoformy sú ľahko zistiteľné na 2D géli. Fosforylácia nahradzuje neutrálne hydroxylové skupiny na aminokyselinách serín a treonín za negatívne nabité fosfátové skupiny s pKs okolo 1.2 a 6.5. Pod pH 5,5 fosfáty pridajú jeden záporný náboj, pri pH 6,5 pridajú 1,5 záporného náboja, nad pH 7,5 pridávajú 2 záporné náboje. Relatívne množstvo každej izoformy môže byť taktiež ľahko a rýchlo určené z intenzity zafarbenia na 2D géli.

V niektorých veľmi špecifických prípadoch je možné detegovať fosforyláciu ako zmenu elektroforetickej pohyblivosti proteínu, ktorú je možné sledovať pomocou jednoduchých jednorozmerných SDS-PAGE gélov.[20] Väčšina fosforylovaných miest, kde boli takéto zmeny pohyblivosti popísané, spadajú do kategórie SP a TP miest (tj. prolínové zvyšky nasledované fosforylovanými serínovými alebo treonínovými zvyškami).

Na určenie miesta fosforylácie proteínov boli nedávno použité rozsiahle analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie, pričom bolo publikovaných veľké množstvo štúdií, ktoré identifikovali veľké množstvá nových fosforylačných mierst.[21][22] Hmotnostná spektrometria je pre takéto analýzy ideálna, pretože pridávanie fosforylácie vedie ku zvýšeniu hmotnosti proteínu. Avšak vysoko presné hmotnostné spektrometre sú finančne veľmi nákladné a tak je možné tieto analýzy vykonávať len vo vysokošpecializovaných laboratóriách.

Určenie podrobnej charakteristiky fosforylovaných lokalít je veľmi náročné a kvantifikácia fosforylovaných proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie vyžaduje použitie izotopov.[23] Relatívnu kvantifikáciu je možné získať použitím rôznych diferenciálnych metód, napr. označovaním prostredníctvom izotopov.[24] Existuje taktiež niekoľko kvantitatívnych metod proteinovej fosforylácie vrátane fluorescenčných a imunologických, FRET, TRF. Medzi ďalšie metody, ktoré možno pre kvantifikáciu použiť, patrí fluorescenčná polarizácia, fluorescenčná spektroskopia, gélová retardačná analýza (EMSA) a mnohé iné.[25][26]

Iné druhy[upraviť | upraviť zdroj]

ATP, “vysokoenergetické” médium v bunke je syntetizované v mitochondriách pridaním tretej fosfátovej skupiny na ADP v procese oxidačnej fosforylácie. ATP je taktiež syntetizované počas procesu glykolýzy. Ďalší spôsob tvorby ATP je syntéza využívajúca slnečnú energiu v procese fosforylácie v chloroplastoch rastlinných buniek. Fosforylácia cukrov je často prvou fázou katabolizmu. Umožňuje bunkám hromadiť cukry, pretože fosfátová skupina bráni molekulám difundovať naspäť cez ich transportéry.

Referencie[upraviť | upraviť zdroj]

Tento článok je čiastočný alebo úplný preklad článku Phosphorylation na anglickej Wikipédii (číslo revízie nebolo určené).

  1. (1906). "The cleavage products of vitellin". J. Biol. Chem. 2 (1): 127–133.
  2. (October 1932). "Serinephosphoric acid obtained on hydrolysis of vitellinic acid". J. Biol. Chem. 98 (1): 109–114.
  3. (December 1954). "The enzymatic phosphorylation of proteins". J. Biol. Chem. 211 (2): 969–80. PMID 13221602.
  4. a b Cozzone AJ (1988). "Protein phosphorylation in prokaryotes". Annu. Rev. Microbiol. 42: 97–125. DOI:10.1146/annurev.mi.42.100188.000525. PMID 2849375.
  5. a b (December 1989). "Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria". Microbiol. Rev. 53 (4): 450–90. PMID 2556636.
  6. (July 1998). "The Two-Component System . Regulation of Diverse Signaling Pathways in Prokaryotes and Eukaryotes". Plant Physiol. 117 (3): 723–31. DOI:10.1104/PPSOE.117.3.723. PMID 9662515.
  7. (1998). "The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and regulation". Annu Rev Biophys Biomol Struct 27: 133–64. DOI:10.1146/annurev.biophys.27.1.133. PMID 9646865.
  8. a b (2011). "Phosphorylation of basic amino acid residues in proteins: important but easily missed". Acta Biochim Pol 58 (2): 137–47. PMID 21623415.
  9. (2005). "Ser/Thr/Tyr protein phosphorylation in bacteria - for long time neglected, now well established". J Mol Microbiol Biotechnol 9 (3–4): 125–31. DOI:10.1159/000089641. PMID 16415586.
  10. (March 1999). "Regulation of p53 Function and Stability by Phosphorylation". Mol. Cell. Biol. 19 (3): 1751–8. PMID 10022862.
  11. (February 1996). "p53 in signaling checkpoint arrest or apoptosis". Curr. Opin. Genet. Dev. 6 (1): 12–8. DOI:10.1016/S0959-437X(96)90004-0. PMID 8791489.
  12. (May 1998). "Essential role for protein kinase B (PKB) in insulin-induced glycogen synthase kinase 3 inactivation. Characterization of dominant-negative mutant of PKB". J. Biol. Chem. 273 (21): 13150–6. DOI:10.1074/jbc.273.21.13150. PMID 9582355.
  13. (October 2003). "Protein tyrosine kinases Src and Csk: a tail's tale". Curr Opin Chem Biol 7 (5): 580–5. DOI:10.1016/j.cbpa.2003.08.009. PMID 14580561.
  14. Babior BM (March 1999). "NADPH oxidase: an update". Blood 93 (5): 1464–76. PMID 10029572.
  15. (November 2006). "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks". Cell 127 (3): 635–48. DOI:10.1016/j.cell.2006.09.026. PMID 17081983.
  16. (2007). "Phosphoproteomics for the discovery of kinases as cancer biomarkers and drug targets". Proteomics - Clinical Applications 1 (9): 1042–1057. DOI:10.1002/prca.200700102. PMID 21136756.
  17. (2009). "Functional Organization of the S. cerevisiae Phosphorylation Network". Cell 136 (5): 952–963. DOI:10.1016/j.cell.2008.12.039. PMID 19269370.
  18. (September 2000). "Eukaryotic signal transduction via histidine-aspartate phosphorelay". J. Cell. Sci. 113 (18): 3141–50. PMID 10954413.
  19. phospho antibody. exactantigen.com. prístup: 2009-01-22.
  20. Kovacs KA, Steinmann M, Magistretti PJ, Halfon O, Cardinaux JR (Sept. 2003). "CCAAT/enhancer-binding protein family members recruit the coactivator CREB-binding protein and trigger its phosphorylation". J Biol. Chem. 278 (38): 36959–65. DOI:10.1074/jbc.M303147200. PMID 12857754.
  21. (February 2007). "Qualitative and quantitative analyses of protein phosphorylation in naive and stimulated mouse synaptosomal preparations". Mol. Cell Proteomics 6 (2): 283–93. DOI:10.1074/mcp.M600046-MCP200. PMID 17114649.
  22. (April 2008). "Quantitative analysis of synaptic phosphorylation and protein expression". Mol. Cell Proteomics 7 (4): 684–96. DOI:10.1074/mcp.M700170-MCP200. PMID 18056256.
  23. (June 2003). "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12): 6940–5. DOI:10.1073/pnas.0832254100. PMID 12771378.
  24. (2002). "Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags". J. Proteome Res. 1 (1): 47–54. DOI:10.1021/pr015509n. PMID 12643526.
  25. Olive DM (October 2004). "Quantitative methods for the analysis of protein phosphorylation in drug development". Expert Rev Proteomics 1 (3): 327–41. DOI:10.1586/14789450.1.3.327. PMID 15966829.
  26. (March 2005). "A cell-based immunocytockemical assay for monitoring kinase signaling pathways and drug efficacy". Anal. Biochem. 338 (1): 136–42. DOI:10.1016/j.ab.2004.11.015. PMID 15707944.

Externé odkazy[upraviť | upraviť zdroj]